مائوسین ہیوی چین سے آگے انسانی کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی متفاوتیت

فطرت ڈاٹ کام پر جانے کا شکریہ۔ آپ جس براؤزر کا ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے محدود CSS سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربہ کے لیے، ہم تازہ ترین براؤزر ورژن (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں مطابقت موڈ کو غیر فعال کرنے) کا مشورہ دیتے ہیں۔ مزید برآں، مسلسل تعاون کو یقینی بنانے کے لیے، یہ سائٹ اسٹائل اور جاوا اسکرپٹ سے پاک ہوگی۔
کنکال کے عضلات ایک متضاد ٹشو ہے جو بنیادی طور پر myofibrils پر مشتمل ہوتا ہے، جسے انسانوں میں عام طور پر تین اقسام میں تقسیم کیا جاتا ہے: ایک "سست" (ٹائپ 1) اور دو "تیز" (قسم 2A اور 2X)۔ تاہم، روایتی myofibril اقسام کے درمیان اور اس کے اندر ہیٹروجنیٹی کو اچھی طرح سے سمجھا نہیں جاتا ہے۔ ہم نے بالترتیب ہیومن واسٹس لیٹرالیس سے 1050 اور 1038 انفرادی myofibrils پر ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک اپروچ کا اطلاق کیا۔ پروٹومک مطالعہ میں مرد شامل تھے، اور ٹرانسکرومک مطالعہ میں 10 مرد اور 2 خواتین شامل تھیں۔ مائوسین ہیوی چین آئسفارمز کے علاوہ، ہم نے میٹابولک پروٹینز، رائبوسومل پروٹینز، اور سیلولر جنکشنل پروٹین کو کثیر جہتی انٹرمیوفائبریل تغیر کے ذرائع کے طور پر شناخت کیا۔ مزید برآں، سست اور تیز رفتار ریشوں کے جھرمٹ کی شناخت کے باوجود، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ قسم 2X ریشے فینوٹائپک طور پر دوسرے تیز مروڑ والے ریشوں سے الگ نہیں ہیں۔ مزید برآں، myosin ہیوی چین پر مبنی درجہ بندی نیملین میوپیتھیز میں myofiber فینوٹائپ کو بیان کرنے کے لیے ناکافی ہے۔ مجموعی طور پر، ہمارا ڈیٹا کثیر جہتی myofiber heterogeneity کی تجویز کرتا ہے، جس میں تغیر کے ذرائع myosin ہیوی چین isoforms سے آگے بڑھتے ہیں۔
سیلولر ہیٹروجنیٹی تمام حیاتیاتی نظاموں کی ایک موروثی خصوصیت ہے، جس سے خلیوں کو بافتوں اور خلیات کی مختلف ضروریات کو پورا کرنے میں مہارت حاصل ہوتی ہے۔ ہیوی چین (MYH) isoforms.2 یہ ابتدائی طور پر ان کے pH ATPase عدم استحکام، 3,4 اور بعد میں MYH کے ان کے سالماتی اظہار پر مبنی تھا۔ اقسام.6 اس کے باوجود، فیلڈ اب بھی myofiber کی درجہ بندی کے لیے بنیادی درجہ بندی کے طور پر MYH پر بہت زیادہ انحصار کرتا ہے، یہ نقطہ نظر ممکنہ طور پر ابتدائی چوہا مطالعہ کی حدود اور اہم تعصبات سے متاثر ہوتا ہے جس کے MYH اظہار کے پروفائلز اور فائبر کی اقسام کی حد انسانوں سے مختلف ہوتی ہے۔ ایک انٹرمیڈیٹ (اور اس وجہ سے نمائندہ) MYH اظہار پروفائل کے ساتھ مخلوط عضلات۔
اس طرح، طاقتور "اومکس" ٹولز کا استعمال کرتے ہوئے کنکال کے پٹھوں کے ریشے کے تنوع کی غیرجانبدارانہ تحقیقات اہم لیکن چیلنجنگ بھی ہے، جس کا ایک حصہ کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی کثیر الجہتی نوعیت کی وجہ سے ہے۔ تاہم، ٹرانسکرپٹومکس 8,9 اور پروٹومکس 10 ٹیکنالوجیز نے حالیہ برسوں میں مختلف تکنیکی ترقی کی وجہ سے حساسیت میں انقلاب برپا کیا ہے، جس سے سنگل فائبر ریزولوشن پر کنکال کے پٹھوں کا تجزیہ کیا جا سکتا ہے۔ نتیجے کے طور پر، سنگل فائبر تنوع کی خصوصیت اور ایٹروفک محرکات اور 11,12,13,14,15,16,17,18 پر ان کے ردعمل میں نمایاں پیش رفت ہوئی ہے۔ اہم بات یہ ہے کہ، ان تکنیکی ترقیوں میں کلینیکل ایپلی کیشنز ہیں، جس سے بیماری سے وابستہ ڈس ریگولیشن کی مزید تفصیلی اور درست خصوصیات کی نشاندہی کی جا سکتی ہے۔ مثال کے طور پر، نیملین میوپیتھی کی پیتھو فزیالوجی، جو کہ سب سے زیادہ وراثت میں ملنے والی پٹھوں کی بیماریوں میں سے ایک ہے (MIM 605355 اور MIM 161800)، پیچیدہ اور مبہم ہے۔ 19,20 اس لیے، کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی بے ضابطگی کی ایک بہتر خصوصیت اس بیماری کے بارے میں ہماری سمجھ میں اہم پیش رفت کا باعث بن سکتی ہے۔
ہم نے انسانی بایپسی کے نمونوں سے دستی طور پر الگ تھلگ سنگل کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کے ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک تجزیہ کے طریقے تیار کیے اور انہیں ہزاروں ریشوں پر لاگو کیا، جس سے ہمیں انسانی کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی سیلولر ہیٹروجنیٹی کی تحقیقات کرنے کی اجازت ملتی ہے۔ اس کام کے دوران، ہم نے پٹھوں کے ریشوں کی ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک فینوٹائپنگ کی طاقت کا مظاہرہ کیا اور میٹابولک، رائبوسومل، اور سیلولر جنکشنل پروٹین کو انٹرفائبر تغیر کے اہم ذرائع کے طور پر شناخت کیا۔ مزید برآں، اس پروٹومک ورک فلو کا استعمال کرتے ہوئے، ہم نے سنگل کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں نیماٹوڈ میوپیتھی کی طبی مطابقت کو نمایاں کیا، جس سے MYH پر مبنی فائبر کی قسم سے آزاد غیر آکسیڈیٹیو ریشوں کی طرف ایک مربوط تبدیلی کا انکشاف ہوا۔
انسانی کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی متفاوتیت کی تحقیقات کے لئے، ہم نے واحد کنکال کے پٹھوں کے ریشوں (شکل 1A اور ضمنی اعداد و شمار 1A) کے ٹرانسکرپٹوم اور پروٹوم تجزیہ کو قابل بنانے کے لئے دو ورک فلو تیار کیے ہیں۔ ہم نے نمونے کے ذخیرہ کرنے اور RNA اور پروٹین کی سالمیت کے تحفظ سے لے کر ہر ایک نقطہ نظر کے لیے تھرو پٹ کو بہتر بنانے تک کئی طریقہ کار کو تیار اور بہتر بنایا۔ ٹرانسکرپٹوم کے تجزیے کے لیے، یہ ریورس ٹرانسکرپشن کے ابتدائی مرحلے پر نمونے کے لیے مخصوص مالیکیولر بارکوڈز داخل کرکے حاصل کیا گیا، جس سے 96 ریشوں کو موثر بہاو پروسیسنگ کے لیے جمع کیا جا سکتا ہے۔ روایتی سنگل سیل اپروچز کے مقابلے گہری ترتیب (±1 ملین ریڈز فی فائبر) نے ٹرانسکرپٹوم ڈیٹا کو مزید تقویت بخشی۔ 21 پروٹومکس کے لیے، ہم نے ہائی تھرو پٹ کو برقرار رکھتے ہوئے پروٹوم کی گہرائی کو بہتر بنانے کے لیے timsTOF ماس اسپیکٹومیٹر پر DIA-PASEF ڈیٹا کے حصول کے ساتھ مل کر ایک مختصر کرومیٹوگرافک گریڈینٹ (21 منٹ) استعمال کیا۔ 22,23 صحت مند کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی متفاوتیت کی تحقیقات کے لئے، ہم نے 14 صحت مند بالغ عطیہ دہندگان کے 1,050 انفرادی ریشوں کے ٹرانسکرپٹوم اور 5 صحت مند بالغ عطیہ دہندگان کے 1,038 ریشوں کے پروٹوم کی خصوصیت کی (ضمنی جدول 1)۔ اس مقالے میں، ان ڈیٹاسیٹس کو بالترتیب 1,000-فائبر ٹرانسکروم اور پروٹوم کہا جاتا ہے۔ ہمارے نقطہ نظر نے 1,000-فائبر ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک تجزیوں میں کل 27,237 ٹرانسکرپٹس اور 2,983 پروٹین کا پتہ لگایا (شکل 1A، سپلیمنٹری ڈیٹاسیٹس 1–2)۔ ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک ڈیٹاسیٹس کو> 1,000 دریافت شدہ جینز اور 50% درست اقدار فی فائبر کے لیے فلٹر کرنے کے بعد، ٹرانسکرپٹوم اور پروٹوم میں بالترتیب 925 اور 974 ریشوں کے لیے بایو انفارمیٹکس کے تجزیے کیے گئے۔ فلٹرنگ کے بعد، فی فائبر میں اوسطاً 4257 ± 1557 جینز اور 2015 ± 234 پروٹین (مطلب ± SD) کا پتہ چلا، جس میں محدود بین الفرادی تغیر (ضمنی اعداد و شمار 1B–C، سپلیمنٹری ڈیٹا سیٹس 3–4) تھا۔ تاہم، تمام شرکاء میں موضوع کے اندر کی تبدیلی زیادہ واضح تھی، ممکنہ طور پر مختلف لمبائیوں اور کراس سیکشنل علاقوں کے ریشوں کے درمیان RNA/پروٹین کی پیداوار میں فرق کی وجہ سے۔ زیادہ تر پروٹینز (> 2000) کے لیے، تغیر کا گتانک 20% سے کم تھا (ضمنی شکل 1D)۔ دونوں طریقوں نے پٹھوں کے سنکچن کے لئے انتہائی اہم دستخطوں کے ساتھ ٹرانسکرپٹس اور پروٹین کی ایک وسیع متحرک رینج کو حاصل کرنے کی اجازت دی (مثال کے طور پر، ACTA1، MYH2، MYH7، TNNT1، TNNT3) (ضمنی اعداد و شمار 1E–F)۔ زیادہ تر شناخت شدہ خصوصیات ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک ڈیٹاسیٹس (ضمنی اعداد و شمار 1G) کے درمیان مشترک تھیں، اور ان خصوصیات کی اوسط UMI/LFQ کی شدت معقول حد تک اچھی طرح سے منسلک تھی (r = 0.52) (ضمنی اعداد و شمار 1H)۔
ٹرانسکرپٹومکس اور پروٹومکس ورک فلو (BioRender.com کے ساتھ بنایا گیا)۔ MYH7، MYH2، اور MYH1 کے لیے BD ڈائنامک رینج کے منحنی خطوط، اور فائبر قسم کی تفویض کے لیے کیلکولیٹڈ تھریشولڈز۔ E, F ٹرانسکرپٹومکس اور پروٹومکس ڈیٹاسیٹس میں ریشوں میں MYH اظہار کی تقسیم۔ G, H یونیفارم ڈائیورسٹی اپروکسیمیشن اینڈ پروجیکشن (UMAP) پلاٹ برائے ٹرانسکرپٹومکس اور پروٹومکس رنگین MYH پر مبنی فائبر کی قسم۔ I, J فیچر پلاٹ MYH7، MYH2، اور MYH1 اظہار کو ٹرانسکرپٹومکس اور پروٹومکس ڈیٹاسیٹس میں دکھاتے ہیں۔
ہم ابتدائی طور پر ہر ایک فائبر کو MYH پر مبنی فائبر کی قسم تفویض کرنے کے لیے ایک بہترین طریقہ استعمال کرتے ہیں جو اومکس ڈیٹاسیٹس میں MYH اظہار کی اعلیٰ حساسیت اور متحرک حد سے فائدہ اٹھاتا ہے۔ پچھلے مطالعات میں ریشوں کو خالص قسم 1، قسم 2A، قسم 2X، یا مختلف MYHs11,14,24 کے اظہار کے ایک مقررہ فیصد کی بنیاد پر مخلوط کے طور پر لیبل کرنے کے لیے صوابدیدی حدوں کا استعمال کیا گیا ہے۔ ہم نے ایک مختلف نقطہ نظر کا استعمال کیا جس میں ہر فائبر کے اظہار کو MYHs کے ذریعہ درجہ بندی کیا گیا تھا جو ہم ریشوں کو ٹائپ کرنے کے لئے استعمال کرتے تھے: MYH7، MYH2، اور MYH1، بالترتیب قسم 1، قسم 2A، اور 2X ریشوں کے مطابق۔ اس کے بعد ہم نے ہر نتیجے میں آنے والے منحنی خطوط کے نچلے انفلیکشن پوائنٹ کا حساب لگایا اور اسے ہر MYH (شکل 1B–D) کے لیے مثبت (حد سے اوپر) یا منفی (حد سے نیچے) ریشوں کو تفویض کرنے کے لیے ایک حد کے طور پر استعمال کیا۔ یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ MYH7 (شکل 1B) اور MYH2 (شکل 1C) میں پروٹین کی سطح کے مقابلے RNA سطح پر زیادہ الگ آن/آف ایکسپریشن پروفائلز ہیں۔ درحقیقت، پروٹین کی سطح پر، بہت کم ریشوں نے MYH7 کا اظہار نہیں کیا، اور کسی بھی فائبر میں MYH2 کا 100٪ اظہار نہیں تھا۔ اس کے بعد ہم نے ہر ڈیٹاسیٹ میں تمام ریشوں کو MYH پر مبنی فائبر کی قسمیں تفویض کرنے کے لیے پہلے سے طے شدہ اظہار کی حدوں کا استعمال کیا۔ مثال کے طور پر، MYH7+/MYH2-/MYH1- فائبرز کو ٹائپ 1 کے لیے تفویض کیا گیا تھا، جب کہ MYH7-/MYH2+/MYH1+ فائبر کو مخلوط قسم 2A/2X کے لیے تفویض کیا گیا تھا (مکمل تفصیل کے لیے ضمنی جدول 2 دیکھیں)۔ تمام ریشوں کو جمع کرتے ہوئے، ہم نے RNA (Figure 1E) اور پروٹین (Figure 1F) دونوں سطحوں پر MYH پر مبنی فائبر کی اقسام کی نمایاں طور پر ایک جیسی تقسیم کا مشاہدہ کیا، جبکہ MYH پر مبنی فائبر کی اقسام کی نسبتاً ساخت افراد میں مختلف ہوتی ہے، جیسا کہ توقع کی جاتی ہے (ضمنی شکل 2A)۔ زیادہ تر ریشوں کو خالص قسم 1 (34–35٪) یا قسم 2A (36–38٪) کے طور پر درجہ بندی کیا گیا تھا، حالانکہ مخلوط قسم کے 2A/2X ریشوں کی ایک قابل ذکر تعداد کا بھی پتہ چلا تھا (16–19٪)۔ ایک حیرت انگیز فرق یہ ہے کہ خالص قسم کے 2X ریشوں کا پتہ صرف RNA کی سطح پر ہی پایا جا سکتا ہے، لیکن پروٹین کی سطح پر نہیں، یہ تجویز کرتا ہے کہ تیز رفتار MYH اظہار کم از کم جزوی طور پر نقل کے بعد ریگولیٹ ہوتا ہے۔
ہم نے اینٹی باڈی پر مبنی ڈاٹ بلاٹنگ کا استعمال کرتے ہوئے اپنے پروٹومکس پر مبنی MYH فائبر ٹائپنگ کے طریقہ کار کی توثیق کی، اور دونوں طریقوں نے خالص قسم 1 اور ٹائپ 2A فائبرز کی شناخت میں 100 فیصد معاہدہ حاصل کیا (ضمنی شکل 2B دیکھیں)۔ تاہم، پروٹومکس پر مبنی نقطہ نظر زیادہ حساس تھا، مخلوط ریشوں کی شناخت میں زیادہ موثر تھا، اور ہر فائبر میں ہر MYH جین کے تناسب کو درست کرنے میں۔ یہ اعداد و شمار کنکال کے پٹھوں کے فائبر کی اقسام کو نمایاں کرنے کے لیے ایک مقصدی، انتہائی حساس اومکس پر مبنی نقطہ نظر کو استعمال کرنے کی تاثیر کو ظاہر کرتے ہیں۔
اس کے بعد ہم نے ٹرانسکرپٹومکس اور پروٹومکس کے ذریعہ فراہم کردہ مشترکہ معلومات کا استعمال کیا تاکہ myofibers کو ان کے مکمل ٹرانسکرپٹوم یا پروٹوم کی بنیاد پر معروضی طور پر درجہ بندی کیا جاسکے۔ جہتی کو چھ پرنسپل اجزاء (ضمنی اعداد و شمار 3A – B) تک کم کرنے کے لئے یکساں کئی گنا قریب اور پروجیکشن (UMAP) طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے، ہم ٹرانسکروم (شکل 1G) اور پروٹوم (شکل 1H) میں myofiber تغیر کو دیکھنے کے قابل تھے۔ خاص طور پر، مایوفائبرز کو شرکاء (ضمنی اعداد و شمار 3C–D) یا ٹیسٹنگ دنوں (ضمنی اعداد و شمار 3E) کے ذریعہ ٹرانسکرپٹومکس یا پروٹومکس ڈیٹاسیٹس میں گروپ نہیں کیا گیا تھا، یہ تجویز کرتا ہے کہ کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں اندرون مضمون تغیرات موضوع کے درمیان تغیر سے زیادہ ہے۔ UMAP پلاٹ میں، "تیز" اور "سست" myofibers کی نمائندگی کرنے والے دو الگ کلسٹر سامنے آئے (اعداد و شمار 1G–H)۔ MYH7+ (سست) myofibers کو UMAP1 کے مثبت قطب پر کلسٹر کیا گیا تھا، جبکہ MYH2+ اور MYH1+ (تیز) myofibers کو UMAP1 (اعداد و شمار 1I–J) کے منفی قطب پر کلسٹر کیا گیا تھا۔ تاہم، MYH اظہار کی بنیاد پر فاسٹ ٹویچ فائبر کی اقسام (یعنی ٹائپ 2A، ٹائپ 2X، یا مکسڈ 2A/2X) کے درمیان کوئی فرق نہیں کیا گیا، یہ تجویز کرتا ہے کہ MYH1 (Figure 1I–J) یا دیگر کلاسیکی 2X myofiber مارکر جیسے ACTN3 یا MYLK2 (SupplementA) کے درمیان کوئی فرق نہیں ہے۔ myofiber کی اقسام جب پورے ٹرانسکرپٹوم یا پروٹوم پر غور کریں۔ مزید برآں، MYH2 اور MYH7 کے مقابلے میں، کچھ ٹرانسکرپٹس یا پروٹینز مثبت طور پر MYH1 (Supplementary Figs. 4C–H) کے ساتھ منسلک تھے، یہ تجویز کرتے ہیں کہ MYH1 کی کثرت myofiber ٹرانسکرپٹوم/proteome کی مکمل عکاسی نہیں کرتی ہے۔ UMAP کی سطح پر تین MYH isoforms کے مخلوط اظہار کا اندازہ کرتے وقت اسی طرح کے نتائج پر پہنچے تھے (ضمیمہ انجیر۔ 4I–J)۔ اس طرح، جب کہ 2X ریشوں کی شناخت صرف MYH کی مقدار کی بنیاد پر ٹرانسکرپٹ کی سطح پر کی جا سکتی ہے، MYH1+ ریشوں کو دوسرے تیز ریشوں سے ممتاز نہیں کیا جا سکتا جب پورے ٹرانسکرپٹوم یا پروٹوم پر غور کیا جائے۔
MYH سے آگے سست فائبر ہیٹروجنیٹی کی ابتدائی تلاش کے طور پر، ہم نے چار قائم شدہ سست فائبر قسم کے مخصوص پروٹینوں کا اندازہ کیا: TPM3، TNNT1، MYL3، اور ATP2A22۔ سست فائبر ذیلی قسمیں زیادہ دکھائی دیتی ہیں، اگرچہ کامل نہیں، پیئرسن کا تعلق MYH7 کے ساتھ ٹرانسکرپٹومکس (ضمنی شکل 5A) اور پروٹومکس (ضمنی شکل 5B) دونوں میں ہے۔ ٹرانسکرومکس (ضمنی شکل 5C) اور پروٹومکس (ضمنی شکل 5D) میں بالترتیب تمام جین/پروٹین ذیلی قسموں کے ذریعہ تقریباً 25% اور 33% سست ریشوں کو خالص سست ریشوں کے طور پر درجہ بندی نہیں کیا گیا تھا۔ لہذا، ایک سے زیادہ جین/پروٹین ذیلی قسموں پر مبنی سست فائبر کی درجہ بندی اضافی پیچیدگی کو متعارف کراتی ہے، حتیٰ کہ ان پروٹینوں کے لیے جو فائبر کی قسم کے لیے مخصوص ہیں۔ اس سے پتہ چلتا ہے کہ کسی ایک جین/پروٹین فیملی کے آئسفارمز پر مبنی فائبر کی درجہ بندی کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی حقیقی نسبت کو مناسب طور پر ظاہر نہیں کرسکتی ہے۔
پورے اومکس ماڈل کے پیمانے پر انسانی کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی فینوٹائپک تغیر کو مزید دریافت کرنے کے لئے، ہم نے پرنسپل جزو تجزیہ (PCA) (شکل 2A) کا استعمال کرتے ہوئے ڈیٹا کی غیر جانبدارانہ جہتی کمی کو انجام دیا۔ UMAP پلاٹوں کی طرح، نہ تو شریک کار اور نہ ہی ٹیسٹنگ ڈے نے PCA کی سطح پر فائبر کلسٹرنگ کو متاثر کیا (ضمنی اعداد و شمار 6A–C)۔ دونوں ڈیٹاسیٹس میں، MYH پر مبنی فائبر کی قسم کی وضاحت PC2 کے ذریعے کی گئی تھی، جس میں سست ٹوئچ ٹائپ 1 ریشوں کا ایک کلسٹر اور فاسٹ ٹویچ ٹائپ 2A، ٹائپ 2X، اور مخلوط 2A/2X فائبرز (شکل 2A) پر مشتمل دوسرا کلسٹر دکھایا گیا تھا۔ دونوں ڈیٹاسیٹس میں، یہ دونوں کلسٹر مخلوط قسم کے 1/2A ریشوں کی ایک چھوٹی سی تعداد سے جڑے ہوئے تھے۔ جیسا کہ توقع کی گئی ہے، مرکزی پی سی ڈرائیوروں کے زیادہ نمائندگی کے تجزیے نے اس بات کی تصدیق کی ہے کہ پی سی 2 کو کنٹریکٹائل اور میٹابولک دستخطوں سے چلایا گیا تھا (شکل 2B اور ضمنی اعداد و شمار 6D–E، سپلیمنٹری ڈیٹاسیٹس 5–6)۔ مجموعی طور پر، MYH پر مبنی فائبر کی قسم PC2 کے ساتھ مسلسل تغیرات کی وضاحت کے لیے کافی پائی گئی، سوائے نام نہاد 2X ریشوں کے جو کہ فاسٹ کلسٹر کے اندر پورے ٹرانسکرپٹوم میں تقسیم کیے گئے تھے۔
A. MYH کی بنیاد پر فائبر کی قسم کے مطابق رنگین ٹرانسکرپٹوم اور پروٹوم ڈیٹاسیٹس کے پرنسپل اجزاء کا تجزیہ (PCA)۔ B. PC2 اور PC1 میں ٹرانسکرپٹ اور پروٹین ڈرائیوروں کی افزودگی کا تجزیہ۔ شماریاتی تجزیہ کلسٹر پروفائلر پیکج اور بنجمینی-ہچبرگ ایڈجسٹڈ پی-ویلیوز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ C, D. پروٹوم میں ٹرانسکرپٹوم اور کوسٹامیری جی او کی اصطلاحات میں انٹر سیلولر آسنجن جین آنٹولوجی (GO) کی شرائط کے مطابق رنگین PCA پلاٹ۔ تیر نقل اور پروٹین ڈرائیوروں اور ان کی سمتوں کی نمائندگی کرتے ہیں۔ E, F. یونیفارم مینی فولڈ اپروکسیمیشن اینڈ پروجیکشن (UMAP) طبی لحاظ سے متعلقہ خصوصیات کے پلاٹ جو سست/تیز فائبر قسم سے آزاد ایکسپریشن گریڈینٹ دکھاتے ہیں۔ G, H. ٹرانسکرپٹوم اور پروٹوم میں PC2 اور PC1 ڈرائیوروں کے درمیان ارتباط۔
غیر متوقع طور پر، MYH پر مبنی myofiber قسم نے صرف دوسری اعلی ترین ڈگری تغیر پذیری (PC2) کی وضاحت کی، جس سے یہ تجویز کیا گیا کہ MYH-based myofiber type (PC1) سے غیر متعلق دیگر حیاتیاتی عوامل کنکال کے پٹھوں میں فائبر کی نسبت کو منظم کرنے میں اہم کردار ادا کرتے ہیں۔ PC1 میں سرفہرست ڈرائیوروں کے زیادہ نمائندگی کے تجزیے سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ PC1 میں تغیر کا تعین بنیادی طور پر ٹرانسکرپٹوم میں سیل سیل آسنجن اور رائبوزوم مواد، اور پروٹوم میں کوسٹامیرس اور رائبوسومل پروٹین (شکل 2B اور ضمنی اعداد و شمار 6D–E، Data Suplement 7) سے ہوتا ہے۔ کنکال کے پٹھوں میں، کوسٹامیرس زیڈ ڈسک کو سارکولیما سے جوڑتے ہیں اور فورس ٹرانسمیشن اور سگنلنگ میں شامل ہوتے ہیں۔ سیل سیل آسنجن (ٹرانسکرپٹوم، فگر 2C) اور کوسٹامیر (پروٹوم، فگر 2D) کی خصوصیات کا استعمال کرتے ہوئے 25 تشریح شدہ PCA پلاٹوں نے PC1 میں بائیں جانب مضبوط تبدیلی کا انکشاف کیا، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ یہ خصوصیات بعض ریشوں میں افزودہ ہیں۔
UMAP کی سطح پر myofiber کلسٹرنگ کے مزید تفصیلی امتحان سے یہ بات سامنے آئی ہے کہ زیادہ تر خصوصیات میں myofiber ذیلی کلسٹر مخصوص کی بجائے myofiber قسم سے آزاد MYH پر مبنی ایکسپریشن گریڈینٹ کی نمائش ہوتی ہے۔ یہ تسلسل پیتھولوجیکل حالات (شکل 2E) سے وابستہ کئی جینوں کے لیے دیکھا گیا، جیسے کہ CHCHD10 (عصبی عضلہ کی بیماری)، SLIT3 (عضلات کی ایٹروفی)، CTDNEP1 (پٹھوں کی بیماری)۔ یہ تسلسل پورے پروٹوم میں بھی دیکھا گیا، بشمول اعصابی عوارض (UGDH)، انسولین سگنلنگ (PHIP)، اور ٹرانسکرپشن (HIST1H2AB) (شکل 2F) سے وابستہ پروٹین۔ اجتماعی طور پر، یہ اعداد و شمار مختلف مائیوفائبرز میں فائبر قسم سے آزاد سست/تیز مروڑ ہیٹروجنیٹی میں تسلسل کی نشاندہی کرتے ہیں۔
دلچسپ بات یہ ہے کہ، PC2 میں ڈرائیور جینز نے اچھا ٹرانسکرپٹوم-پروٹوم ارتباط (r = 0.663) (شکل 2G) دکھایا، جو تجویز کرتا ہے کہ سست اور تیز رفتار مروڑ فائبر کی قسمیں، اور خاص طور پر کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی سنکچن اور میٹابولک خصوصیات، نقلی طور پر ریگولیٹ ہیں۔ تاہم، PC1 میں ڈرائیور جینز نے کوئی ٹرانسکرپٹوم-پروٹوم ارتباط (r = -0.027) (شکل 2H) نہیں دکھایا، یہ تجویز کرتا ہے کہ سست/تیز مروڑ فائبر کی قسموں سے غیر متعلق تغیرات کو نقل کے بعد بڑے پیمانے پر منظم کیا جاتا ہے۔ چونکہ PC1 میں تغیرات کی بنیادی طور پر وضاحت رائبوسومل جین آنٹولوجی کی اصطلاحات سے کی گئی تھی، اور یہ دیکھتے ہوئے کہ رائبوسومز پروٹین کے ترجمے میں فعال طور پر حصہ لے کر اور اس پر اثر انداز ہو کر خلیے میں ایک اہم اور خصوصی کردار ادا کرتے ہیں، اس کے بعد ہم اس غیر متوقع رائبوسومل ہیٹروجنیٹی کی چھان بین کے لیے نکلے۔
ہم نے سب سے پہلے GOCC اصطلاح "cytoplasmic ribosome" (شکل 3A) میں پروٹین کی نسبتا کثرت کے مطابق پروٹومکس کے پرنسپل جزو تجزیہ پلاٹ کو رنگین کیا۔ اگرچہ یہ اصطلاح PC1 کے مثبت پہلو پر افزودہ ہے، جس کے نتیجے میں ایک چھوٹا سا میلان ہوتا ہے، رائبوسومل پروٹین PC1 (شکل 3A) کی دونوں سمتوں میں تقسیم کو چلاتے ہیں۔ PC1 کے منفی پہلو پر افزودہ رائبوسومل پروٹینوں میں RPL18، RPS18، اور RPS13 (شکل 3B) شامل ہیں، جبکہ RPL31، RPL35، اور RPL38 (شکل 3C) PC1 کے مثبت پہلو کے اہم ڈرائیور تھے۔ دلچسپ بات یہ ہے کہ RPL38 اور RPS13 کا دوسرے ٹشوز (ضمنی شکل 7A) کے مقابلے میں کنکال کے پٹھوں میں بہت زیادہ اظہار کیا گیا تھا۔ پی سی 1 میں یہ مخصوص رائبوسومل دستخط ٹرانسکرپٹوم (ضمنی شکل 7B) میں نہیں دیکھے گئے تھے، جو نقل کے بعد کے ضابطے کی نشاندہی کرتے ہیں۔
A. پرنسپل اجزاء کا تجزیہ (PCA) پلاٹ پروٹوم میں سائٹوپلاسمک رائبوسومل جین آنٹولوجی (GO) کی اصطلاحات کے مطابق رنگین۔ تیر پی سی اے پلاٹ میں پروٹین ثالثی تغیر کی سمت کی نشاندہی کرتے ہیں۔ لائن کی لمبائی دیئے گئے پروٹین کے پرنسپل جزو سکور کے مساوی ہے۔ B, C. PCA نمایاں پلاٹ برائے RPS13 اور RPL38۔ D. سائٹوپلاسمک رائبوسومل پروٹین کا غیر زیر نگرانی درجہ بندی کا کلسٹرنگ تجزیہ۔ E. 80S رائبوزوم کا ساختی ماڈل (PDB: 4V6X) کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں مختلف کثرت کے ساتھ رائبوسومل پروٹین کو نمایاں کرتا ہے۔ F. مختلف سٹوچیومیٹری کے ساتھ رائبوسومل پروٹین جو mRNA ایگزٹ چینل کے قریب مقامی ہیں۔
رائبوسومل ہیٹروجنیٹی اور اسپیشلائزیشن کے تصورات پہلے تجویز کیے جا چکے ہیں، جس کے تحت الگ الگ رائبوسوم ذیلی آبادی (ربوسومل ہیٹروجنیٹی) کی موجودگی مخصوص mRNA ٹرانسکرپٹ پولز 34 (رائبوزوم اسپیشلائزیشن) کے سلیکٹیو ترجمہ کے ذریعے مختلف ٹشوز32 اور سیل33 میں پروٹین ٹرانسلیشن کو براہ راست متاثر کر سکتی ہے۔ کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں مشترکہ اظہار کردہ رائبوسومل پروٹین کی ذیلی آبادیوں کی نشاندہی کرنے کے لئے، ہم نے پروٹوم میں رائبوسومل پروٹینوں کا ایک غیر نگرانی شدہ درجہ بندی کا کلسٹرنگ تجزیہ کیا (شکل 3D، ضمنی ڈیٹا سیٹ 8)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، رائبوسومل پروٹین MYH کی بنیاد پر فائبر کی قسم کے ذریعے کلسٹر نہیں ہوئے تھے۔ تاہم، ہم نے رائبوسومل پروٹین کے تین الگ الگ کلسٹرز کی نشاندہی کی۔ پہلا کلسٹر (ribosomal_cluster_1) RPL38 کے ساتھ مربوط ہے اور اس وجہ سے مثبت PC1 پروفائل کے ساتھ ریشوں میں اظہار میں اضافہ ہوا ہے۔ دوسرا کلسٹر (ribosomal_cluster_2) RPS13 کے ساتھ مربوط ہے اور منفی PC1 پروفائل کے ساتھ ریشوں میں بلند ہے۔ تیسرا کلسٹر (ribosomal_cluster_3) کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں مربوط تفریق کا اظہار نہیں کرتا ہے اور اسے "بنیادی" کنکال کے پٹھوں کی رائبوسومل پروٹین سمجھا جا سکتا ہے۔ دونوں رائبوسومل کلسٹرز 1 اور 2 میں رائبوسومل پروٹین ہوتے ہیں جو پہلے متبادل ترجمہ (جیسے RPL10A، RPL38، RPS19، اور RPS25) کو منظم کرتے ہوئے دکھایا گیا ہے اور فعال طور پر ترقی کو متاثر کرتا ہے (مثال کے طور پر، RPL10A، RPL38)۔ ریشوں میں رائبوسومل پروٹین نے بھی تسلسل دکھایا (ضمنی شکل 7C)۔
رائبوزوم کے اندر متفاوت رائبوسومل پروٹین کے مقام کو دیکھنے کے لیے، ہم نے انسانی 80S رائبوزوم (پروٹین ڈیٹا بینک: 4V6X) (شکل 3E) کا ساختی ماڈل استعمال کیا۔ مختلف رائبوسومل کلسٹروں سے تعلق رکھنے والے رائبوسومل پروٹینوں کو الگ تھلگ کرنے کے بعد، ان کے مقامات کو قریب سے جوڑا نہیں گیا تھا، جس سے یہ معلوم ہوتا ہے کہ ہمارا نقطہ نظر رائبوسوم کے بعض علاقوں/فرکشنز کے لیے افزودگی فراہم کرنے میں ناکام رہا۔ تاہم، دلچسپ بات یہ ہے کہ کلسٹر 2 میں بڑے سبونائٹ پروٹین کا تناسب کلسٹر 1 اور 3 (ضمنی شکل 7D) کے مقابلے میں کم تھا۔ ہم نے مشاہدہ کیا کہ کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں تبدیل شدہ اسٹوچیومیٹری کے ساتھ پروٹین بنیادی طور پر رائبوزوم سطح (شکل 3E) پر مقامی تھے، جو مختلف mRNA آبادیوں میں اندرونی رائبوزوم انٹری سائٹ (IRES) عناصر کے ساتھ تعامل کرنے کی صلاحیت کے مطابق تھے، اس طرح منتخب ترجمہ کو مربوط کرتے ہیں۔ 40، 41 مزید برآں، کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں تبدیل شدہ اسٹوچیومیٹری والے بہت سے پروٹین فعال علاقوں جیسے ایم آر این اے ایگزٹ ٹنل (فگر 3 ایف) کے قریب واقع تھے، جو منتخب طور پر مترجم کی لمبائی اور مخصوص پیپٹائڈس کی گرفتاری کو منظم کرتے ہیں۔ 42 خلاصہ طور پر، ہمارے اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ کنکال کے پٹھوں کے رائبوسومل پروٹین کی سٹوچیومیٹری ہیٹروجنیٹی کو ظاہر کرتی ہے، جس کے نتیجے میں کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کے درمیان فرق ہوتا ہے۔
اس کے بعد ہم تیز رفتار اور سست مروڑ والے فائبر دستخطوں کی شناخت کرنے اور ان کے نقلی ضابطے کے طریقہ کار کو دریافت کرنے کے لیے نکلے۔ دو ڈیٹاسیٹس (اعداد و شمار 1G–H اور 4A–B) میں UMAP کے ذریعہ بیان کردہ تیز رفتار اور سست مروڑ فائبر کلسٹرز کا موازنہ کرتے ہوئے، ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک تجزیوں نے بالترتیب 1366 اور 804 امتیازی طور پر وافر خصوصیات کی نشاندہی کی (اعداد و شمار 4A–B، ڈیٹا 19)۔ ہم نے sarcomeres (مثال کے طور پر، tropomyosin اور troponin)، excitation-contractation coupling (SERCA isoforms)، اور انرجی میٹابولزم (جیسے، ALDOA اور CKB) سے متعلق دستخطوں میں متوقع فرق کا مشاہدہ کیا۔ مزید برآں، ٹرانسکرپٹس اور پروٹین کو ریگولیٹ کرنے والے پروٹین کو تیز رفتار اور سست مروڑ والے ریشوں (جیسے، USP54، SH3RF2، USP28، اور USP48) (اعداد و شمار 4A – B) میں مختلف طریقے سے ظاہر کیا گیا تھا۔ مزید برآں، مائکروبیل پروٹین جین RP11-451G4.2 (DWORF)، جو پہلے بھیڑ کے پٹھوں کے فائبر کی اقسام 43 میں مختلف طور پر ظاہر کیا گیا ہے اور کارڈیک عضلات 44 میں SERCA کی سرگرمی کو بڑھاتا ہے، کو آہستہ آہستہ کنکال کے پٹھوں کے ریشوں (شکل 4A) میں نمایاں طور پر اپ گریڈ کیا گیا تھا۔ اسی طرح، انفرادی فائبر کی سطح پر، میٹابولزم سے متعلق لییکٹیٹ ڈیہائیڈروجنیز آئسفارمز (LDHA اور LDHB، Figure 4C اور سپلیمنٹری فگر 8A) 45,46 کے ساتھ ساتھ پہلے نامعلوم فائبر قسم کے مخصوص دستخطوں (جیسے USP24، USP28، USP28، USP28) جیسے معروف دستخطوں میں نمایاں فرق دیکھا گیا۔ DPYSL3) (شکل 4C)۔ ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک ڈیٹاسیٹس (ضمنی اعداد و شمار 8B) کے درمیان امتیازی طور پر اظہار کردہ خصوصیات کا ایک اہم اوورلیپ تھا، نیز ایک تہہ میں تبدیلی کا ارتباط جو بنیادی طور پر سارکومیری خصوصیات (ضمنی اعداد و شمار 8C) کے زیادہ واضح امتیازی اظہار کے ذریعہ کارفرما تھا۔ خاص طور پر، کچھ دستخطوں (مثلاً USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) نے صرف پروٹومک سطح پر نقل کے بعد کے مضبوط ضابطے کو ظاہر کیا اور اس میں سست/تیز ٹویچ فائبر قسم کے مخصوص ایکسپریشن پروفائلز تھے (ضمنی شکل 8C)۔
A اور B آتش فشاں پلاٹوں کا موازنہ کرتے ہوئے سست اور تیز کلسٹرز جن کی شناخت یکساں مینی فولڈ اپروکسیمیشن اینڈ پروجیکشن (UMAP) پلاٹوں سے اعداد و شمار 1G–H میں کی گئی ہے۔ رنگین نقطے ٹرانسکرپٹس یا پروٹین کی نمائندگی کرتے ہیں جو ایف ڈی آر <0.05 میں نمایاں طور پر مختلف ہوتے ہیں، اور گہرے نقطے ٹرانسکرپٹس یا پروٹین کی نمائندگی کرتے ہیں جو لاگ چینج میں نمایاں طور پر مختلف ہوتے ہیں تجزیہ جس کے بعد بنجمینی – ہوچبرگ ایڈجسٹمنٹ ایک سے زیادہ موازنہ (پروٹومکس) کے لیے۔ C سست اور تیز ریشوں کے درمیان منتخب امتیازی طور پر اظہار شدہ جین یا پروٹین کے دستخطی پلاٹ۔ D نمایاں طور پر الگ الگ اظہار شدہ نقلوں اور پروٹینوں کی افزودگی کا تجزیہ۔ دونوں ڈیٹاسیٹس میں اوور لیپنگ ویلیوز کو افزودہ کیا جاتا ہے، ٹرانسکرپٹوم ویلیوز کو صرف ٹرانسکرپٹوم میں افزودہ کیا جاتا ہے، اور پروٹوم ویلیوز کو صرف پروٹوم میں افزودہ کیا جاتا ہے۔ اعداد و شمار کا تجزیہ کلسٹر پروفائلر پیکج کا استعمال کرتے ہوئے بینجمینی-ہچبرگ ایڈجسٹ شدہ پی-ویلیوز کے ساتھ کیا گیا۔ E. فائبر کی قسم کے مخصوص ٹرانسکرپشن عوامل جن کی شناخت SCENIC کے ذریعے کی گئی ہے SCENIC سے ماخوذ ریگولیٹر کی خصوصیت کے اسکور اور فائبر کی اقسام کے درمیان امتیازی mRNA اظہار کی بنیاد پر۔ F. منتخب ٹرانسکرپشن عوامل کی پروفائلنگ جو سست اور تیز ریشوں کے درمیان فرق کے ساتھ ظاہر ہوتی ہے۔
اس کے بعد ہم نے مختلف نمائندگی والے جینوں اور پروٹینوں (شکل 4D، ضمنی ڈیٹا سیٹ 13) کا زیادہ نمائندگی کا تجزیہ کیا۔ دو ڈیٹاسیٹس کے درمیان مختلف خصوصیات کے لیے راستے کی افزودگی نے متوقع اختلافات کو ظاہر کیا، جیسے کہ فیٹی ایسڈ β-آکسیڈیشن اور کیٹون میٹابولزم کے عمل (سست ریشے)، myofilament/ پٹھوں کا سکڑاؤ (بالترتیب تیز اور سست ریشے)، اور کاربوہائیڈریٹ کیٹابولک عمل (تیز ریشے)۔ سیرین/تھریونائن پروٹین فاسفیٹیس کی سرگرمی بھی تیز ریشوں میں بلند کی گئی تھی، جو کہ ریگولیٹری اور کیٹلیٹک فاسفیٹیز سبونائٹس (PPP3CB، PPP1R3D، اور PPP1R3A) جیسی خصوصیات کے ذریعے کارفرما تھی، جو کہ گلائکوجن میٹابولزم کو منظم کرنے کے لیے جانا جاتا ہے (47) (اضافی ڈیگو ای ریزیس)۔ فاسٹ ریشوں میں افزودہ دیگر راستوں میں پروٹیوم میں پروسیسنگ (P-) باڈیز (YTHDF3، TRIM21، LSM2) شامل ہیں (ضمنی شکل 8F)، ممکنہ طور پر پوسٹ ٹرانسکرپشن ریگولیشن (48) میں شامل ہیں، اور ٹرانسکرپشن فیکٹر ایکٹیویٹی (SREBF1، RXRG، RORAME) میں شامل ہیں۔ سست ریشوں کو oxidoreductase سرگرمی (BDH1, DCXR, TXN2) (ضمنی شکل 8H)، امائڈ بائنڈنگ (CPTP، PFDN2، CRYAB) (ضمنی شکل 8I)، ایکسٹرا سیلولر میٹرکس (CTSD، ADAMTSL4، FSupplementary)، اور 1888 میں افزودہ کیا گیا تھا۔ رسیپٹر-لیگینڈ سرگرمی (FNDC5, SPX, NENF) (ضمنی شکل 8K)۔
ٹرانسکرپشن ریگولیشن کے بارے میں مزید بصیرت حاصل کرنے کے لیے جس میں سست/تیز پٹھوں کے فائبر کی قسم کی خصوصیات شامل ہیں، ہم نے SCENIC49 (ضمنی ڈیٹا سیٹ 14) کا استعمال کرتے ہوئے ٹرانسکرپشن فیکٹر افزودگی کا تجزیہ کیا۔ تیز اور سست پٹھوں کے ریشوں (شکل 4E) کے درمیان نقل کے بہت سے عوامل نمایاں طور پر افزودہ تھے۔ اس میں MAFA جیسے ٹرانسکرپشن عوامل شامل تھے، جو پہلے پٹھوں کے فائبر کی تیز نشوونما سے منسلک تھے، 50 کے ساتھ ساتھ متعدد ٹرانسکرپشن عوامل جو پہلے پٹھوں کے فائبر کی قسم کے مخصوص جین پروگراموں سے منسلک نہیں تھے۔ ان میں سے، PITX1، EGR1، اور MYF6 فاسٹ پٹھوں کے ریشوں میں سب سے زیادہ افزودہ ٹرانسکرپشن عوامل تھے (شکل 4E)۔ اس کے برعکس، ZSCAN30 اور EPAS1 (جسے HIF2A بھی کہا جاتا ہے) سست پٹھوں کے ریشوں (شکل 4E) میں سب سے زیادہ افزودہ نقل کے عوامل تھے۔ اس کے ساتھ مطابقت رکھتے ہوئے، MAFA کا اظہار UMAP خطے میں تیز رفتار پٹھوں کے ریشوں کے مطابق اعلی سطح پر کیا گیا تھا، جبکہ EPAS1 کا اظہار برعکس پیٹرن تھا (شکل 4F)۔
معروف پروٹین کوڈنگ جینز کے علاوہ، متعدد نان کوڈنگ آر این اے بائیو ٹائپس ہیں جو انسانی نشوونما اور بیماری کے ضابطے میں شامل ہو سکتے ہیں۔ 51, 52 ٹرانسکرپٹوم ڈیٹاسیٹس میں، کئی نان کوڈنگ RNAs فائبر کی قسم کی مخصوصیت (فگر 5A اور سپلیمنٹری ڈیٹاسیٹ 15) کو ظاہر کرتے ہیں، بشمول LINC01405، جو کہ سست ریشوں کے لیے انتہائی مخصوص ہے اور مائٹوکونڈریل مایوپیتھی کے مریضوں کے پٹھوں میں کمی کی اطلاع ہے۔ 53 اس کے برعکس، RP11-255P5.3، lnc-ERCC5-5 جین (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54 سے مطابقت رکھتا ہے، تیز فائبر قسم کی مخصوصیت کو ظاہر کرتا ہے۔ دونوں LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) اور RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) کنکال کے پٹھوں کی مخصوصیت کو ظاہر کرتے ہیں (ضمنی اعداد و شمار 9A–B) اور کوئی معلوم کنٹریکٹائل جین نہیں ہیں، جو ان کے پڑوس میں مخصوص کردار ادا کرتے ہوئے تجویز کرتے ہیں۔ ہمسایہ کنٹریکٹائل جینز کو ریگولیٹ کرنے کے بجائے فائبر کی اقسام کو ریگولیٹ کرنا۔ بالترتیب LINC01405 اور RP11-255P5.3 کے سست/تیز فائبر قسم کے مخصوص ایکسپریشن پروفائلز کی تصدیق RNAscope (اعداد و شمار 5B–C) کے ذریعے کی گئی۔
A. نان کوڈنگ آر این اے ٹرانسکرپٹس کو نمایاں طور پر سست اور تیز مروڑ والے پٹھوں کے ریشوں میں منظم کیا جاتا ہے۔ B. نمائندہ آر این اے اسکوپ کی تصاویر جو بالترتیب LINC01405 اور RP11-255P5.3 کی سست اور تیز مروڑ فائبر کی قسم کی خصوصیت کو ظاہر کرتی ہیں۔ اسکیل بار = 50 μm۔ C. myofiber قسم کے مخصوص نان کوڈنگ RNA اظہار کی مقدار کا تعین جیسا کہ RNAscope (آزاد افراد سے n = 3 بایپسیز، ہر فرد کے اندر تیز اور سست پٹھوں کے ریشوں کا موازنہ کرتے ہوئے)۔ دو دم والے طالب علم کے ٹی ٹیسٹ کا استعمال کرتے ہوئے شماریاتی تجزیہ کیا گیا۔ باکس پلاٹ درمیانی اور پہلے اور تیسرے کوارٹائل کو دکھاتے ہیں، سرگوشیوں کے ساتھ کم سے کم اور زیادہ سے زیادہ اقدار کی طرف اشارہ کرتے ہیں۔ D. De novo مائکروبیل پروٹین کی شناخت کا ورک فلو (BioRender.com کے ساتھ بنایا گیا)۔ E. مائکروبیل پروٹین LINC01405_ORF408:17441:17358 خاص طور پر سست کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں ظاہر ہوتا ہے (n=5 بایپسیز آزاد شرکاء سے، ہر شریک میں تیز اور سست پٹھوں کے ریشوں کا موازنہ کرتے ہوئے)۔ اعداد و شمار کا تجزیہ لِم لکیری ماڈل کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جس میں تجرباتی بایسیئن نقطہ نظر کے ساتھ مل کر کیا گیا، جس کے بعد پی-ویلیو ایڈجسٹمنٹ کے ساتھ متعدد موازنہ کے لیے بنجمینی-ہچبرگ کا طریقہ استعمال کیا گیا۔ باکس پلاٹ درمیانی، پہلے اور تیسرے چوتھائی کو دکھاتے ہیں، سرگوشیوں کے ساتھ زیادہ سے زیادہ/کم سے کم اقدار کی طرف اشارہ کرتے ہیں۔
حال ہی میں، مطالعے سے پتہ چلتا ہے کہ بہت سے پوٹیٹو نان کوڈنگ ٹرانسکرپٹس نقل شدہ مائکروبیل پروٹین کو انکوڈ کرتے ہیں، جن میں سے کچھ پٹھوں کے کام کو منظم کرتے ہیں۔ 44, 55 ممکنہ فائبر قسم کی مخصوصیت کے ساتھ مائکروبیل پروٹین کی شناخت کرنے کے لیے، ہم نے 1000 فائبر ٹرانسکرپٹوم ڈیٹاسیٹ (شکل 5D) میں پائے جانے والے نان کوڈنگ ٹرانسکرپٹس (n = 305) کے سلسلے پر مشتمل ایک کسٹم فاسٹا فائل کا استعمال کرتے ہوئے اپنے 1000 فائبر پروٹوم ڈیٹاسیٹ کو تلاش کیا۔ ہم نے 22 مختلف ٹرانسکرپٹس سے 197 مائکروبیل پروٹینوں کی نشاندہی کی، جن میں سے 71 کو سست اور تیز کنکال کے پٹھوں کے ریشوں (ضمنی اعداد و شمار 9C اور سپلیمنٹری ڈیٹا سیٹ 16) کے درمیان فرق سے منظم کیا گیا تھا۔ LINC01405 کے لیے، تین مائکروبیل پروٹین پروڈکٹس کی نشاندہی کی گئی تھی، جن میں سے ایک نے اس کے ٹرانسکرپٹ (فگر 5E اور سپلیمنٹری فگر 9D) میں اسی طرح کی سست فائبر کی خصوصیت ظاہر کی۔ اس طرح، ہم نے LINC01405 کو ایک جین کے طور پر شناخت کیا جو ایک مائکروبیل پروٹین کو انکوڈنگ کرتا ہے جو سست کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کے لیے مخصوص ہے۔
ہم نے انفرادی پٹھوں کے ریشوں کی بڑے پیمانے پر پروٹومک خصوصیات کے لیے ایک جامع ورک فلو تیار کیا اور صحت مند ریاستوں میں فائبر ہیٹروجنیٹی کے ریگولیٹرز کی نشاندہی کی۔ ہم نے اس ورک فلو کو یہ سمجھنے کے لیے لاگو کیا کہ نیملین میوپیتھی کس طرح کنکال کے پٹھوں میں فائبر کی نسبت کو متاثر کرتی ہے۔ نیملین مایوپیتھیز پٹھوں کی موروثی بیماریاں ہیں جو پٹھوں کی کمزوری کا باعث بنتی ہیں اور متاثرہ بچوں میں سانس کی تکلیف، سکلیوسس، اور اعضاء کی محدود نقل و حرکت سمیت متعدد پیچیدگیاں ہوتی ہیں۔ 19,20 عام طور پر، نیملین مایوپیتھیز میں، ایکٹین الفا 1 (ACTA1) جیسے جینز میں روگجنک مختلف حالتوں کے نتیجے میں سست مروڑ فائبر میوفائبر مرکب کا غلبہ ہوتا ہے، حالانکہ یہ اثر متفاوت ہے۔ ایک قابل ذکر رعایت ٹراپونن T1 نیملین میوپیتھی (TNNT1) ہے، جس میں تیز ریشوں کا غلبہ ہے۔ اس طرح، نیملین میوپیتھیز میں مشاہدہ کیے جانے والے کنکال کے پٹھوں کے ریشے کی بے ضابطگی کے بنیادی فرق کی بہتر تفہیم ان بیماریوں اور میوفائبر کی قسم کے درمیان پیچیدہ تعلقات کو کھولنے میں مدد کر سکتی ہے۔
صحت مند کنٹرولز (n=3 فی گروپ) کے مقابلے میں، ACTA1 اور TNNT1 جینز میں اتپریورتن والے نیملین میوپیتھی کے مریضوں سے الگ تھلگ myofibers نے نشان زدہ myofiber atrophy یا dystrophy کو دکھایا (شکل 6A، ضمنی جدول 3)۔ اس نے دستیاب مواد کی محدود مقدار کی وجہ سے پروٹومک تجزیہ کے لیے اہم تکنیکی چیلنجز پیش کیے ہیں۔ اس کے باوجود، ہم 272 کنکال myofibers میں 2485 پروٹین کا پتہ لگانے کے قابل تھے. کم از کم 1000 مقداری پروٹین فی فائبر کے لیے فلٹر کرنے کے بعد، 250 ریشوں کو بعد میں بائیو انفارمیٹکس تجزیہ کا نشانہ بنایا گیا۔ فلٹرنگ کے بعد، فی فائبر اوسطاً 1573 ± 359 پروٹین کی مقدار طے کی گئی (ضمنی شکل 10A، ضمنی ڈیٹا سیٹ 17–18)۔ خاص طور پر، فائبر کے سائز میں نمایاں کمی کے باوجود، نیملین میوپیتھی کے مریضوں کے نمونوں کی پروٹوم گہرائی صرف معمولی طور پر کم ہوئی تھی۔ مزید یہ کہ، ہماری اپنی FASTA فائلوں (بشمول نان کوڈنگ ٹرانسکرپٹس) کا استعمال کرتے ہوئے ان ڈیٹا پر کارروائی کرنے سے ہمیں نیملین میوپیتھی کے مریضوں (ضمنی ڈیٹا سیٹ 19) سے سکیلیٹل مائیوفائبرز میں پانچ مائکروبیل پروٹینوں کی شناخت کرنے کی اجازت دی گئی۔ پروٹوم کی متحرک رینج نمایاں طور پر وسیع تھی، اور کنٹرول گروپ میں کل پروٹین پچھلے 1000-فائبر پروٹوم تجزیہ (ضمنی شکل 10B–C) کے نتائج کے ساتھ اچھی طرح سے جڑے ہوئے تھے۔
A. ACTA1 اور TNNT1 نیملین میوپیتھیز (NM) میں MYH پر مبنی فائبر ایٹروفی یا ڈسٹروفی اور فائبر کی مختلف اقسام کی برتری کو ظاہر کرنے والی مائکروسکوپک تصاویر۔ اسکیل بار = 100 μm۔ ACTA1 اور TNNT1 مریضوں میں داغدار ہونے کی تولیدی صلاحیت کو یقینی بنانے کے لیے، نمائندہ تصویروں کو منتخب کرنے سے پہلے مریضوں کے تین بایپسی کو دو سے تین بار (چار حصے فی کیس) داغ دیا گیا تھا۔ B. MYH کی بنیاد پر شرکاء میں فائبر کی قسم کا تناسب۔ C. نیملین میوپیتھیز اور کنٹرول والے مریضوں میں کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کا پرنسپل جزو تجزیہ (PCA) پلاٹ۔ D. نیملین مایوپیتھیز کے مریضوں کے کنکال کے پٹھوں کے ریشے اور کنٹرول پی سی اے پلاٹ پر پیش کیا گیا ہے جو کہ شکل 2 میں تجزیہ کردہ 1000 ریشوں سے طے کیا گیا ہے۔ مثال کے طور پر، آتش فشاں پلاٹ ACTA1 اور TNNT1 نیملین مایوپیتھیز کے درمیان فرق کا موازنہ کرتے ہوئے، اور TNNT1 کے ساتھ حصہ لینے والوں کے درمیان فرق کا موازنہ کرتے ہیں۔ myopathies رنگین حلقے ایسے پروٹین کو ظاہر کرتے ہیں جو π <0.05 پر نمایاں طور پر مختلف تھے، اور گہرے نقطے پروٹین کو ظاہر کرتے ہیں جو FDR <0.05 پر نمایاں طور پر مختلف تھے۔ شماریاتی تجزیہ لما لکیری ماڈل کے طریقہ کار اور تجرباتی بایسیئن طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، جس کے بعد بنجمینی-ہچبرگ طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے متعدد موازنہوں کے لیے پی-ویلیو ایڈجسٹمنٹ کی گئی تھی۔ H. پورے پروٹوم اور قسم 1 اور 2A ریشوں میں نمایاں طور پر الگ الگ اظہار شدہ پروٹینوں کی افزودگی کا تجزیہ۔ شماریاتی تجزیہ کلسٹر پروفائلر پیکج اور بنجمینی-ہچبرگ ایڈجسٹڈ پی-ویلیوز کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ I, J. ایکسٹرا سیلولر میٹرکس اور مائٹوکونڈریل جین آنٹولوجی (GO) اصطلاحات کے ذریعے رنگین پرنسپل کمپوننٹ انیلیسس (PCA) پلاٹ۔
چونکہ نیملین مایوپیتھیز کنکال کے پٹھوں میں MYH- اظہار کرنے والی myofiber اقسام کے تناسب کو متاثر کر سکتی ہے، 19,20 ہم نے پہلے نیملین میوپیتھیز اور کنٹرول والے مریضوں میں MYH- اظہار کرنے والے myofiber کی اقسام کا جائزہ لیا۔ ہم نے 1000 myofiber پرکھ (Supplementary Figs. 10D–E) کے لیے پہلے بیان کردہ غیر جانبدارانہ طریقہ استعمال کرتے ہوئے myofiber کی قسم کا تعین کیا اور دوبارہ خالص 2X myofibers (شکل 6B) کی شناخت کرنے میں ناکام رہے۔ ہم نے myofiber قسم پر nemaline myopathies کے ایک متفاوت اثر کا مشاہدہ کیا، کیونکہ ACTA1 اتپریورتنوں کے ساتھ دو مریضوں میں قسم 1 myofibers کا تناسب بڑھ گیا تھا، جبکہ TNNT1 نیملین میوپیتھی کے دو مریضوں میں قسم 1 myofibers کا تناسب کم تھا (شکل 6B)۔ درحقیقت، MYH2 اور فاسٹ ٹروپونن isoforms (TNNC2، TNNI2، اور TNNT3) کے اظہار میں ACTA1-nemaline myopathies میں کمی واقع ہوئی تھی، جبکہ MYH7 اظہار TNNT1-nemaline myopathies میں کم ہوا تھا (ضمنی شکل 11A)۔ یہ نیملین مایوپیتھیز میں متفاوت myofiber قسم کے سوئچنگ کی پچھلی رپورٹس سے مطابقت رکھتا ہے۔ 19,20 ہم نے ان نتائج کی تصدیق امیونو ہسٹو کیمسٹری کے ذریعے کی اور پایا کہ ACTA1-nemaline myopathy کے مریضوں میں ٹائپ 1 myofibers کا غلبہ تھا، جبکہ TNNT1-nemaline myophybers کے مریضوں میں opposite 6 (مائیوفائبرز) کا نمونہ تھا۔
سنگل فائبر پروٹوم کی سطح پر، ACTA1 اور TNNT1 نیملین میوپیتھی کے مریضوں کے کنکال کے پٹھوں کے ریشے زیادہ تر کنٹرول ریشوں کے ساتھ کلسٹر ہوتے ہیں، TNNT1 نیملین میوپیتھی ریشے عام طور پر سب سے زیادہ متاثر ہوتے ہیں (شکل 6C)۔ یہ خاص طور پر اس وقت واضح ہوا جب ہر مریض کے لیے سیوڈو فلیٹڈ ریشوں کے پرنسپل اجزاء کے تجزیہ (PCA) پلاٹوں کی منصوبہ بندی کرتے ہوئے، TNNT1 نیملین میوپیتھی کے مریض 2 اور 3 کنٹرول کے نمونوں سے سب سے زیادہ دور دکھائی دیتے ہیں (ضمنی اعداد و شمار 11B، سپلیمنٹری ڈیٹا سیٹ20)۔ بہتر طور پر یہ سمجھنے کے لیے کہ میوپیتھی کے مریضوں کے ریشے صحت مند ریشوں سے کس طرح موازنہ کرتے ہیں، ہم نے صحت مند بالغ شرکاء کے 1,000 ریشوں کے پروٹومک تجزیہ سے حاصل کردہ تفصیلی معلومات کا استعمال کیا۔ ہم نے 1000-فائبر پروٹومک تجزیہ (شکل 6D) سے حاصل کردہ پی سی اے پلاٹ پر میوپیتھی ڈیٹاسیٹ (ACTA1 اور TNNT1 نیملین میوپیتھی کے مریض اور کنٹرولز) سے فائبر کا تخمینہ لگایا۔ کنٹرول ریشوں میں PC2 کے ساتھ MYH فائبر کی اقسام کی تقسیم 1000-فائبر پروٹومک تجزیہ سے حاصل کردہ فائبر کی تقسیم کی طرح تھی۔ تاہم، نیملین میوپیتھی کے مریضوں میں زیادہ تر ریشے PC2 کو نیچے منتقل کر دیتے ہیں، صحت مند فاسٹ ٹویچ ریشوں کے ساتھ اوور لیپ کرتے ہوئے، ان کی مقامی MYH فائبر کی قسم سے قطع نظر۔ اس طرح، اگرچہ ACTA1 نیملین میوپیتھی کے مریضوں نے MYH پر مبنی طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے مقدار درست کرنے پر ٹائپ 1 ریشوں کی طرف تبدیلی ظاہر کی، دونوں ACTA1 نیملین میوپیتھی اور TNNT1 نیملین مایوپیتھی نے کنکال کے پٹھوں کے فائبر پروٹوم کو تیز رفتار مروڑ ریشوں کی طرف منتقل کیا۔
اس کے بعد ہم نے ہر مریض گروپ کا صحت مند کنٹرول کے ساتھ براہ راست موازنہ کیا اور بالترتیب ACTA1 اور TNNT1 نیملین میوپیتھیز میں 256 اور 552 مختلف پروٹینوں کی نشاندہی کی (شکل 6E – G اور سپلیمنٹری فگر 11C، سپلیمنٹری ڈیٹا سیٹ 21)۔ جین کی افزودگی کے تجزیے سے مائٹوکونڈریل پروٹین میں مربوط کمی کا انکشاف ہوا (شکل 6H–I، ضمنی ڈیٹا سیٹ 22)۔ حیرت کی بات یہ ہے کہ ACTA1 اور TNNT1 نیملین میوپیتھیس میں فائبر کی اقسام کی امتیازی برتری کے باوجود، یہ کمی MYH پر مبنی فائبر کی قسم سے مکمل طور پر آزاد تھی (شکل 6H اور ضمنی اعداد و شمار 11D–I، ضمنی ڈیٹا سیٹ 23)۔ ACTA1 یا TNNT1 نیملین میوپیتھیس میں تین مائکروبیل پروٹینوں کو بھی منظم کیا گیا تھا۔ ان مائیکرو پروٹینز میں سے دو، ENSG00000215483_TR14_ORF67 (جسے LINC00598 یا Lnc-FOXO1 بھی کہا جاتا ہے) اور ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2) نے صرف 1 قسم کی تفریق کی کثرت ظاہر کی۔ ENSG00000215483_TR14_ORF67 کو پہلے سیل سائیکل ریگولیشن میں کردار ادا کرنے کی اطلاع دی گئی ہے۔ 56 دوسری طرف، ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 کے مطابق) ACTA1-nemaline myopathy میں قسم 1 اور ٹائپ 2A myofibers دونوں میں صحت مند کنٹرول (ضمنی شکل 12A، Data Suplement4) کے مقابلے میں اضافہ ہوا تھا۔ اس کے برعکس، ریبوسومل پروٹین بڑی حد تک نیملین میوپیتھی سے متاثر نہیں ہوئے، حالانکہ ACTA1 نیملین میوپیتھی (تصویر 6E) میں RPS17 کو کم کیا گیا تھا۔
افزودگی کے تجزیے سے ACTA1 اور TNNT1 نیملین مایوپیتھیز میں مدافعتی نظام کے عمل کی اپ گریجشن کا بھی انکشاف ہوا، جبکہ TNNT1 نیملین میوپیتھی (شکل 6H) میں سیل آسنجن میں بھی اضافہ ہوا ہے۔ ان ایکسٹرا سیلولر عوامل کی افزودگی ایکسٹرا سیلولر میٹرکس پروٹینز کی طرف سے ظاہر ہوتی ہے جو PC1 اور PC2 میں PCA کو منفی سمت میں منتقل کرتے ہیں (یعنی، سب سے زیادہ متاثرہ ریشوں کی طرف) (شکل 6J)۔ دونوں مریضوں کے گروپوں نے مدافعتی ردعمل اور سارکولیمل مرمت کے طریقہ کار میں شامل ایکسٹرا سیلولر پروٹین کے بڑھتے ہوئے اظہار کو ظاہر کیا، جیسے اینیکسنز (ANXA1، ANXA2، ANXA5) 57,58 اور ان کے بات چیت کرنے والے پروٹین S100A1159 (ضمنی اعداد و شمار 12B–C)۔ اس عمل کو پہلے بھی پٹھوں کے ڈسٹروفیز 60 میں بڑھانے کی اطلاع دی گئی ہے لیکن، ہمارے علم کے مطابق، اس سے پہلے نیملین میوپیتھیز سے وابستہ نہیں تھا۔ چوٹ لگنے کے بعد سارکولیمل مرمت کے لیے اور myofibers58,61 کے ساتھ نئے بننے والے myocytes کے فیوژن کے لیے اس مالیکیولر مشینری کے عام کام کی ضرورت ہوتی ہے۔ اس طرح، دونوں مریضوں کے گروپوں میں اس عمل کی بڑھتی ہوئی سرگرمی myofiber عدم استحکام کی وجہ سے ہونے والی چوٹ کے لیے ایک اصلاحی ردعمل کی تجویز کرتی ہے۔
ہر نیملین میوپیتھی کے اثرات اچھی طرح سے منسلک تھے (r = 0.736) اور اس نے معقول اوورلیپ دکھایا (ضمنی اعداد و شمار 11A – B) ، جس سے یہ ظاہر ہوتا ہے کہ ACTA1 اور TNNT1 نیملین میوپیتھی کے پروٹوم پر ایک جیسے اثرات ہیں۔ تاہم، کچھ پروٹینوں کو صرف ACTA1 یا TNNT1 نیملین میوپیتھی (ضمنی اعداد و شمار 11A اور C) میں منظم کیا گیا تھا۔ منافع بخش پروٹین MFAP4 TNNT1 نیملین میوپیتھی میں سب سے زیادہ اپ گریڈ شدہ پروٹینوں میں سے ایک تھا لیکن ACTA1 نیملین میوپیتھی میں کوئی تبدیلی نہیں ہوئی۔ SKIC8، HOX جین ٹرانسکرپشن کو ریگولیٹ کرنے کے لیے ذمہ دار PAF1C کمپلیکس کا ایک جزو، TNNT1 نیملین مایوپیتھی میں کم کر دیا گیا تھا لیکن ACTA1 نیملین میوپیتھی (ضمنی شکل 11A) میں متاثر نہیں ہوا تھا۔ ACTA1 اور TNNT1 نیملین مایوپیتھی کے براہ راست موازنہ سے مائٹوکونڈریل پروٹین میں زیادہ کمی اور TNNT1 نیملین میوپیتھی میں مدافعتی نظام کے پروٹین میں اضافے کا انکشاف ہوا (شکل 6G–H اور ضمنی اعداد و شمار 11C اور 11H–I)۔ یہ اعداد و شمار TNNT1 نیملین میوپیتھی (شکل 6A) کے مقابلے TNNT1 نیملین میوپیتھی میں مشاہدہ کردہ زیادہ ایٹروفی/ڈسٹروفی کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں، یہ تجویز کرتے ہیں کہ TNNT1 نیملین میوپیتھی بیماری کی زیادہ شدید شکل کی نمائندگی کرتی ہے۔
اس بات کا جائزہ لینے کے لیے کہ آیا نیملین میوپیتھی کے مشاہدہ شدہ اثرات پورے پٹھوں کی سطح پر برقرار رہتے ہیں، ہم نے TNNT1 نیملین میوپیتھی کے مریضوں کے اسی گروہ سے پٹھوں کے بایپسیوں کا ایک بڑا پروٹومک تجزیہ کیا اور ان کا کنٹرول (n=3 فی گروپ) کے ساتھ موازنہ کیا (ضمنی شکل 13A، ضمیمہ Da5)۔ جیسا کہ توقع کی گئی تھی، بنیادی اجزاء کے تجزیے میں کنٹرول کا گہرا تعلق تھا، جب کہ TNNT1 نیملین میوپیتھی کے مریضوں نے ایک ہی فائبر تجزیہ (ضمیمہ تصویر 13B) کی طرح اعلیٰ نمونہ تغیر پذیری کا مظاہرہ کیا۔ بڑے پیمانے پر تجزیہ نے انفرادی ریشوں کا موازنہ کرکے نمایاں کردہ مختلف پروٹینز (ضمنی شکل 13C، سپلیمنٹری ڈیٹا سیٹ 26) اور حیاتیاتی عمل (ضمنی اعداد و شمار 13D، سپلیمنٹری ڈیٹا سیٹ 27) کو دوبارہ تیار کیا، لیکن مختلف قسم کے اثرات کے لیے مختلف قسم کے اثرات کی صلاحیت کو کھو دیا۔ ریشوں کے پار.
ایک ساتھ لے کر، یہ اعداد و شمار ظاہر کرتے ہیں کہ سنگل مائیو فائیبر پروٹومکس طبی حیاتیاتی خصوصیات کو واضح کر سکتے ہیں جو ٹارگٹڈ طریقوں جیسے کہ امیونو بلوٹنگ سے قابل شناخت نہیں ہیں۔ مزید یہ کہ یہ اعداد و شمار فینوٹائپک موافقت کو بیان کرنے کے لیے اکیلے ایکٹین فائبر ٹائپنگ (MYH) کے استعمال کی حدود کو اجاگر کرتے ہیں۔ درحقیقت، اگرچہ فائبر ٹائپ سوئچنگ ایکٹین اور ٹروپونن نیملین مایوپیتھیز کے درمیان مختلف ہے، دونوں نیملین میوپیتھیز MYH فائبر ٹائپنگ کو سکیلیٹل پٹھوں میں فائبر میٹابولزم سے تیز اور کم آکسیڈیٹیو پٹھوں پروٹوم کی طرف جوڑتی ہیں۔
سیلولر ہیٹروجنیٹی ٹشوز کے لیے ان کے متنوع مطالبات کو پورا کرنے کے لیے اہم ہے۔ کنکال کے پٹھوں میں، اسے اکثر فائبر کی اقسام کے طور پر بیان کیا جاتا ہے جس کی خصوصیات قوت کی پیداوار اور تھکاوٹ کی مختلف ڈگریوں سے ہوتی ہے۔ تاہم، یہ واضح ہے کہ یہ کنکال کے پٹھوں کے ریشے کی تغیر کے صرف ایک چھوٹے سے حصے کی وضاحت کرتا ہے، جو کہ پہلے کی سوچ سے کہیں زیادہ متغیر، پیچیدہ اور کثیر جہتی ہے۔ تکنیکی ترقی نے اب کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کو منظم کرنے والے عوامل پر روشنی ڈالی ہے۔ درحقیقت، ہمارے اعداد و شمار بتاتے ہیں کہ ٹائپ 2 ایکس ریشے ایک الگ کنکال پٹھوں کے فائبر ذیلی قسم نہیں ہوسکتے ہیں۔ مزید یہ کہ، ہم نے میٹابولک پروٹینز، رائبوسومل پروٹینز اور سیل سے وابستہ پروٹین کو کنکال کے پٹھوں کے فائبر کی نسبت کے بڑے عامل کے طور پر شناخت کیا۔ نیماٹوڈ مایوپیتھی والے مریض کے نمونوں پر اپنے پروٹومک ورک فلو کو لاگو کرکے، ہم نے مزید یہ ظاہر کیا کہ MYH پر مبنی فائبر ٹائپنگ کنکال کے پٹھوں کی نسبت کو مکمل طور پر ظاہر نہیں کرتی ہے، خاص طور پر جب نظام پریشان ہو۔ درحقیقت، MYH پر مبنی فائبر کی قسم سے قطع نظر، نیماٹوڈ میوپیتھی کے نتیجے میں تیز اور کم آکسیڈیٹیو ریشوں کی طرف تبدیلی آتی ہے۔
کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کو 19 ویں صدی سے درجہ بندی کیا گیا ہے۔ حالیہ اومکس تجزیوں نے ہمیں مختلف MYH فائبر اقسام کے اظہاری پروفائلز اور مختلف محرکات پر ان کے ردعمل کو سمجھنے کی اجازت دی ہے۔ جیسا کہ یہاں بیان کیا گیا ہے، اومکس اپروچز میں روایتی اینٹی باڈی پر مبنی طریقوں کے مقابلے میں فائبر ٹائپ مارکروں کی مقدار درست کرنے کے لیے زیادہ حساسیت کا فائدہ بھی ہوتا ہے، بغیر کسی کنکال کے پٹھوں کے فائبر کی قسم کی وضاحت کے لیے کسی ایک (یا چند) مارکروں کی مقدار پر انحصار کیے بغیر۔ ہم نے تکمیلی ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک ورک فلوز کا استعمال کیا اور انسانی کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں فائبر ہیٹروجنیٹی کے ٹرانسکرپشن اور پوسٹ ٹرانسکرپشن ریگولیشن کی جانچ کرنے کے لئے نتائج کو مربوط کیا۔ اس ورک فلو کے نتیجے میں ہمارے صحت مند جوانوں کے گروپ کے واسٹس لیٹرالیس میں پروٹین کی سطح پر خالص 2X قسم کے ریشوں کی شناخت کرنے میں ناکامی ہوئی۔ یہ پچھلے سنگل فائبر اسٹڈیز سے مطابقت رکھتا ہے جس میں صحت مند واسٹس لیٹرالیس میں <1% خالص 2X ریشے پائے گئے تھے، حالانکہ مستقبل میں دیگر عضلات میں اس کی تصدیق ہونی چاہیے۔ mRNA کی سطح پر تقریباً خالص 2X ریشوں اور پروٹین کی سطح پر صرف مخلوط 2A/2X ریشوں کے درمیان فرق حیران کن ہے۔ MYH isoform mRNA اظہار سرکیڈین نہیں ہے، 67 یہ تجویز کرتا ہے کہ RNA سطح پر بظاہر خالص 2X ریشوں میں MYH2 شروع ہونے والے سگنل کو "چھوٹ" جانے کا امکان نہیں ہے۔ ایک ممکنہ وضاحت، اگرچہ خالصتاً فرضی، MYH isoforms کے درمیان پروٹین اور/یا mRNA استحکام میں فرق ہو سکتا ہے۔ درحقیقت، کوئی بھی فاسٹ فائبر کسی بھی MYH isoform کے لیے 100% خالص نہیں ہے، اور یہ واضح نہیں ہے کہ آیا MYH1 mRNA اظہار کی سطح 70-90% رینج میں پروٹین کی سطح پر مساوی MYH1 اور MYH2 کی کثرت کا باعث بنے گی۔ تاہم، جب پورے ٹرانسکرپٹوم یا پروٹوم پر غور کیا جائے تو، کلسٹر تجزیہ اعتماد کے ساتھ صرف دو الگ الگ کلسٹروں کی شناخت کرسکتا ہے جو سست اور تیز کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کی نمائندگی کرتے ہیں، قطع نظر ان کی درست MYH ساخت سے۔ یہ سنگل نیوکلئس ٹرانسکرپٹومک اپروچز کا استعمال کرتے ہوئے تجزیوں کے ساتھ مطابقت رکھتا ہے، جو عام طور پر صرف دو الگ الگ myonuclear کلسٹرز کی شناخت کرتے ہیں۔ 68, 69, 70 مزید برآں، اگرچہ پچھلے پروٹومک اسٹڈیز نے ٹائپ 2X ریشوں کی نشاندہی کی ہے، لیکن یہ ریشے باقی فاسٹ ریشوں سے الگ الگ کلسٹر نہیں ہوتے ہیں اور MYH کی بنیاد پر فائبر کی دیگر اقسام کے مقابلے میں بہت کم تعداد میں مختلف پروٹین دکھاتے ہیں۔ 14 یہ نتائج تجویز کرتے ہیں کہ ہمیں 20 ویں صدی کے اوائل میں پٹھوں کے ریشے کی درجہ بندی کے نقطہ نظر کی طرف لوٹنا چاہیے، جس نے انسانی کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کو MYH کی بنیاد پر تین الگ الگ کلاسوں میں نہیں بلکہ ان کی میٹابولک اور سنکچن خصوصیات کی بنیاد پر دو کلسٹروں میں تقسیم کیا تھا۔ 63
زیادہ اہم بات یہ ہے کہ متعدد جہتوں کے ساتھ myofiber heterogeneity پر غور کیا جانا چاہئے۔ پچھلے "اومکس" مطالعات نے اس سمت کی طرف اشارہ کیا ہے، تجویز کیا ہے کہ کنکال کے پٹھوں کے ریشے مجرد کلسٹرز نہیں بناتے ہیں بلکہ ایک تسلسل کے ساتھ ترتیب دیئے جاتے ہیں۔ 11, 13, 14, 64, 71 یہاں، ہم یہ ظاہر کرتے ہیں کہ، کنکال کے پٹھوں کی کنٹریکٹائل اور میٹابولک خصوصیات میں فرق کے علاوہ، myofibers کو سیل سیل کے تعاملات اور ترجمے کے طریقہ کار سے متعلق خصوصیات کے ذریعے فرق کیا جا سکتا ہے۔ درحقیقت، ہم نے کنکال کے پٹھوں کے ریشوں میں رائبوزوم ہیٹروجنیٹی پایا جو سست اور تیز فائبر کی اقسام سے آزاد ہیٹروجنیٹی میں حصہ ڈالتا ہے۔ اس کافی myofiber heterogeneity کی بنیادی وجہ، جو کہ سست اور تیز فائبر کی قسم سے آزاد ہے، ابھی تک واضح نہیں ہے، لیکن یہ پٹھوں کے فاسیکلز کے اندر مخصوص مقامی تنظیم کی طرف اشارہ کر سکتا ہے جو مخصوص قوتوں اور بوجھوں کا بہترین طور پر جواب دیتا ہے، 72 مخصوص سیلولر یا اعضاء سے متعلق مخصوص مواصلت میں دوسرے خلیوں کی اقسام کے ساتھ، انفرادی مائیکرو ماحولیات میں فرق، انفرادی سرگرمی میں فرق۔ myofibers درحقیقت، ribosomal heteroplasmy، یا تو RPL3 اور RPL3L کے پیرالوگس متبادل کے ذریعے یا rRNA کے 2′O-میتھیلیشن کی سطح پر، کنکال کے پٹھوں کے ہائپر ٹرافی76,77 سے وابستہ دکھایا گیا ہے۔ ملٹی اومک اور مقامی ایپلی کیشنز کے ساتھ مل کر انفرادی myofibers کی فنکشنل خصوصیات ملٹی اومک سطح78 پر پٹھوں کی حیاتیات کے بارے میں ہماری سمجھ کو مزید آگے بڑھائیں گی۔
نیملین میوپیتھیز کے مریضوں سے سنگل مائیوفائبرز کے پروٹوم کا تجزیہ کرکے، ہم نے کنکال کے پٹھوں کی کلینکل پیتھوفیسولوجی کو واضح کرنے کے لیے سنگل مائیوفائبر پروٹومکس کی افادیت، تاثیر، اور قابل اطلاق ہونے کا بھی مظاہرہ کیا۔ مزید برآں، اپنے ورک فلو کا عالمی پروٹومک تجزیہ سے موازنہ کرکے، ہم یہ ظاہر کرنے میں کامیاب ہوئے کہ سنگل myofiber پروٹومکس معلومات کی اتنی ہی گہرائی پیدا کرتا ہے جتنی عالمی ٹشو پروٹومکس اور انٹرفائبر ہیٹروجنیٹی اور myofiber قسم کے حساب سے اس گہرائی کو بڑھاتا ہے۔ ACTA1 اور TNNT1 nemaline myopathies میں صحت مند کنٹرول کے مقابلے میں فائبر کی قسم کے تناسب میں متوقع (متغیر ہونے کے باوجود) فرق کے علاوہ، ہم نے MYH-ثالثی فائبر ٹائپ سوئچنگ سے آزاد آکسیڈیٹیو اور ایکسٹرا سیلولر ریموڈلنگ کا بھی مشاہدہ کیا۔ فائبروسس اس سے پہلے TNNT1 نیملین میوپیتھیز میں رپورٹ کیا گیا ہے۔ 19 تاہم، ہمارا تجزیہ ACTA1 اور TNNT15759 کے مریضوں کے مایوفائبرز میں مایو فائیبرز میں ایکسٹرا سیلولر خفیہ تناؤ سے متعلق پروٹین کی بڑھتی ہوئی سطحوں کو بھی ظاہر کرتا ہے۔ نتیجہ، نیملین مایوپیتھی کے مریضوں کے مائیوفائبرز میں اینیکسن کی سطح میں اضافہ شدید ایٹروفک مایوفائبرز کی مرمت کے لیے سیلولر ردعمل کی نمائندگی کر سکتا ہے۔
اگرچہ یہ مطالعہ آج تک انسانوں کے سب سے بڑے سنگل فائبر پورے مسلز اومکس تجزیہ کی نمائندگی کرتا ہے، لیکن یہ بغیر کسی پابندی کے نہیں ہے۔ ہم نے کنکال کے پٹھوں کے ریشوں کو شرکاء کے نسبتا small چھوٹے اور یکساں نمونے اور ایک ہی پٹھوں (واسٹس لیٹرالیس) سے الگ تھلگ کیا۔ لہذا، پٹھوں کی اقسام اور پٹھوں کی فزیالوجی کی انتہا پر مخصوص فائبر کی آبادی کے وجود کو خارج کرنا ناممکن ہے۔ مثال کے طور پر، ہم انتہائی تربیت یافتہ اسپرنٹرز اور/یا طاقت کے ایتھلیٹس79 میں یا عضلاتی غیرفعالیت کے دورانیے کے دوران الٹرا فاسٹ ریشوں (مثلاً خالص 2X فائبر) کے ذیلی سیٹ کے ابھرنے کے امکان کو خارج نہیں کر سکتے۔ مزید برآں، شرکاء کے محدود نمونے کے سائز نے ہمیں فائبر ہیٹروجنیٹی میں جنسی فرق کی تحقیقات کرنے سے روک دیا، کیونکہ فائبر کی قسم کا تناسب مردوں اور عورتوں کے درمیان مختلف معلوم ہوتا ہے۔ مزید برآں، ہم ایک ہی شرکاء کے ایک ہی پٹھوں کے ریشوں یا نمونوں پر ٹرانسکرپٹومک اور پروٹومک تجزیہ کرنے سے قاصر تھے۔ چونکہ ہم اور دوسرے لوگ انتہائی کم نمونہ ان پٹ حاصل کرنے کے لیے اومکس تجزیہ کا استعمال کرتے ہوئے سنگل سیل اور سنگل مائیو فائیبر تجزیوں کو بہتر بناتے رہتے ہیں (جیسا کہ یہاں مائٹوکونڈریل میوپیتھی کے مریضوں کے ریشوں کے تجزیے میں دکھایا گیا ہے)، سنگل ایپ ریشوں کے اندر ملٹی اومکس (اور فنکشنل) طریقوں کو یکجا کرنے کا موقع بن جاتا ہے۔
مجموعی طور پر، ہمارا ڈیٹا کنکال کے پٹھوں کی نسبت کے ٹرانسکرپشن اور پوسٹ ٹرانسکرپشن ڈرائیوروں کی شناخت اور وضاحت کرتا ہے۔ خاص طور پر، ہم ایسے اعداد و شمار پیش کرتے ہیں جو فائبر کی اقسام کی کلاسیکی MYH پر مبنی تعریف سے وابستہ کنکال کے پٹھوں کی فزیالوجی میں ایک دیرینہ عقیدہ کو چیلنج کرتے ہیں۔ ہم اس بحث کی تجدید کرنے کی امید کرتے ہیں اور بالآخر کنکال کے پٹھوں کے فائبر کی درجہ بندی اور متفاوتیت کے بارے میں ہماری سمجھ پر نظر ثانی کریں گے۔
چودہ کاکیشین شرکاء (12 مرد اور 2 خواتین) نے رضاکارانہ طور پر اس مطالعہ میں حصہ لینے پر اتفاق کیا۔ اس مطالعہ کو گینٹ یونیورسٹی ہسپتال کی اخلاقیات کمیٹی (BC-10237) نے منظور کیا، 2013 کے ہیلسنکی اعلامیے کی تعمیل کی، اور ClinicalTrials.gov (NCT05131555) پر رجسٹرڈ ہوا۔ شرکاء کی عمومی خصوصیات کو ضمنی جدول 1 میں پیش کیا گیا ہے۔ زبانی اور تحریری باخبر رضامندی حاصل کرنے کے بعد، شرکاء کا مطالعہ میں حتمی شمولیت سے قبل طبی معائنہ کرایا گیا۔ شرکاء جوان (22-42 سال)، صحت مند (کوئی طبی حالت نہیں، سگریٹ نوشی کی تاریخ نہیں)، اور اعتدال پسند جسمانی طور پر فعال تھے۔ زیادہ سے زیادہ آکسیجن کی مقدار کا تعین جسمانی فٹنس کا اندازہ لگانے کے لیے ایک سٹیپ ایرگومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا جیسا کہ پہلے بیان کیا گیا ہے۔ 81
پٹھوں کی بایپسی کے نمونے آرام اور روزے کی حالت میں 14 دن کے علاوہ تین بار جمع کیے گئے۔ چونکہ یہ نمونے ایک بڑے مطالعے کے حصے کے طور پر اکٹھے کیے گئے تھے، اس لیے شرکاء نے بائیوپسی سے 40 منٹ پہلے پلیسبو (لییکٹوز)، ایک H1-رسیپٹر مخالف (540 mg fexofenadine)، یا H2-رسیپٹر مخالف (40 mg famotidine) استعمال کیا۔ ہم نے پہلے یہ ظاہر کیا ہے کہ یہ ہسٹامائن ریسیپٹر مخالف کنکال کے پٹھوں کی فٹنس کو متاثر نہیں کرتے ہیں، اور ہمارے کوالٹی کنٹرول پلاٹوں میں ریاست سے متعلق کوئی جھرمٹ نہیں دیکھی گئی تھی (ضمنی اعداد و شمار 3 اور 6)۔ ایک معیاری خوراک (41.4 kcal/kg جسمانی وزن، 5.1 g/kg جسمانی وزن کاربوہائیڈریٹ، 1.4 g/kg جسمانی وزن پروٹین، اور 1.6 g/kg جسمانی وزن کی چربی) کو ہر تجرباتی دن سے 48 گھنٹے پہلے تک برقرار رکھا گیا تھا، اور ایک معیاری ناشتہ (1.5 g/kg جسمانی وزن کاربوہائیڈریٹ کا استعمال صبح کے وقت)۔ لوکل اینستھیزیا کے تحت (ایپینفرین کے بغیر 0.5 ملی لیٹر 1% لیڈوکین)، پرکیوٹینیئس برگسٹروم اسپائریشن کا استعمال کرتے ہوئے پٹھوں کے بایپسی واسٹس لیٹرالیس پٹھوں سے حاصل کیے گئے تھے۔ 82 پٹھوں کے نمونے فوری طور پر RNAlater میں ایمبیڈ کیے گئے اور دستی فائبر ڈسیکشن (3 دن تک) تک 4°C پر محفوظ کیے گئے۔
تازہ طور پر الگ تھلگ myofiber بنڈلوں کو کلچر ڈش میں تازہ RNAlater میڈیم میں منتقل کیا گیا تھا۔ اس کے بعد انفرادی myofibers کو دستی طور پر سٹیریو مائکروسکوپ اور باریک چمٹی کا استعمال کرتے ہوئے الگ کیا گیا۔ بایپسی کے مختلف علاقوں سے ریشوں کے انتخاب پر خصوصی توجہ دیتے ہوئے ہر بایپسی سے پچیس ریشوں کو الگ کیا گیا تھا۔ ڈسیکشن کے بعد، ہر فائبر کو آہستہ سے 3 μl لیسیز بفر (سنگل شاٹ سیل لائسس کٹ، بائیو ریڈ) میں ڈبو دیا گیا جس میں پروٹینیز K اور DNase انزائمز شامل ہیں تاکہ ناپسندیدہ پروٹین اور DNA کو ہٹایا جا سکے۔ اس کے بعد سیل لیسز اور پروٹین/ڈی این اے کو ہٹانے کا عمل مختصر بھنور، مائکرو سینٹری فیوج میں مائع کو گھما کر اور کمرے کے درجہ حرارت (10 منٹ) پر انکیوبیشن کے ذریعے شروع کیا گیا۔ اس کے بعد لیسیٹ کو تھرمل سائیکلر (T100، Bio-Rad) میں 5 منٹ کے لیے 37 ° C، 5 منٹ کے لیے 75 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا، اور پھر فوری طور پر مزید کارروائی تک -80 ° C پر محفوظ کیا گیا۔
Illumina سے ہم آہنگ پولیڈینیلیٹڈ RNA لائبریریوں کو QuantSeq-Pool 3′ mRNA-Seq لائبریری پریپ کٹ (Lexogen) کا استعمال کرتے ہوئے 2 μl myofiber lysate سے تیار کیا گیا تھا۔ تفصیلی طریقے کارخانہ دار کے دستی میں مل سکتے ہیں۔ یہ عمل ریورس ٹرانسکرپشن کے ذریعے فرسٹ اسٹرینڈ cDNA کی ترکیب کے ساتھ شروع ہوتا ہے، جس کے دوران منفرد مالیکیولر آئیڈینٹیفائر (UMIs) اور نمونے کے لیے مخصوص i1 بارکوڈز متعارف کرائے جاتے ہیں تاکہ نمونوں کی جمع بندی کو یقینی بنایا جا سکے اور ڈاون اسٹریم پروسیسنگ کے دوران تکنیکی تغیرات کو کم کیا جا سکے۔ 96 myofibers سے cDNA پھر مقناطیسی موتیوں کے ساتھ جمع اور صاف کیا جاتا ہے، جس کے بعد RNA کو ہٹا دیا جاتا ہے اور بے ترتیب پرائمر کا استعمال کرتے ہوئے دوسرے اسٹرینڈ کی ترکیب کی جاتی ہے۔ لائبریری کو مقناطیسی موتیوں سے پاک کیا گیا ہے، پول کے لیے مخصوص i5/i7 ٹیگز شامل کیے گئے ہیں، اور PCR کو بڑھا دیا گیا ہے۔ صاف کرنے کا ایک حتمی مرحلہ Illumina سے مطابقت رکھنے والی لائبریریاں تیار کرتا ہے۔ ہر لائبریری پول کے معیار کا اندازہ ہائی سنسیٹیویٹی سمال فریگمنٹ ڈی این اے اینالیسس کٹ (ایجیلنٹ ٹیکنالوجیز، DNF-477-0500) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔
کیوبیٹ کی مقدار کی بنیاد پر، پولز کو مساوی ارتکاز (2 nM) پر مزید پول کیا گیا۔ اس کے بعد نتیجے میں آنے والے پول کو NovaSeq 6000 انسٹرومنٹ پر معیاری موڈ میں NovaSeq S2 Reagent Kit (1 × 100 nucleotides) کے ساتھ 2 nM لوڈنگ (4% PhiX) کے ساتھ ترتیب دیا گیا۔
ہماری پائپ لائن Lexogen کی QuantSeq Pool ڈیٹا تجزیہ پائپ لائن (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) پر مبنی ہے۔ ڈیٹا کو پہلے i7/i5 انڈیکس کی بنیاد پر bcl2fastq2 (v2.20.0) کے ساتھ ملٹی پلیکس کیا گیا تھا۔ ریڈ 2 کو پھر i1 نمونہ بارکوڈ کی بنیاد پر idemux (v0.1.6) کے ساتھ ڈیملٹی پلیکس کیا گیا تھا اور UMI کی ترتیب umi_tools (v1.0.1) کے ساتھ نکالی گئی تھی۔ اس کے بعد ریڈز کو ایک سے زیادہ راؤنڈز میں cutadapt (v3.4) کے ساتھ تراش دیا گیا تاکہ شارٹ ریڈز (<20 لمبائی میں) یا مکمل طور پر اڈاپٹر کی ترتیب پر مشتمل ریڈز کو ہٹایا جا سکے۔ اس کے بعد ریڈز کو STAR (v2.6.0c) کا استعمال کرتے ہوئے انسانی جینوم کے ساتھ منسلک کیا گیا تھا اور BAM فائلوں کو SAMtools (v1.11) کے ساتھ ترتیب دیا گیا تھا۔ umi_tools (v1.0.1) کا استعمال کرتے ہوئے ڈپلیکیٹ ریڈز کو ہٹا دیا گیا تھا۔ آخر میں، سبریڈ (v2.0.3) میں فیچر کاؤنٹ کا استعمال کرتے ہوئے الائنمنٹ گنتی کی گئی۔ کوالٹی کنٹرول پائپ لائن کے کئی درمیانی مراحل میں FastQC (v0.11.9) کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا گیا۔
مزید تمام بایو انفارمیٹکس پروسیسنگ اور ویژولائزیشن R (v4.2.3) میں انجام دی گئی، بنیادی طور پر Seurat (v4.4.0) ورک فلو کا استعمال کرتے ہوئے۔ 83 لہذا، انفرادی UMI اقدار اور میٹا ڈیٹا میٹرکس کو سیرت آبجیکٹ میں تبدیل کر دیا گیا۔ تمام ریشوں میں سے 30 فیصد سے بھی کم میں ظاہر ہونے والے جینز کو ہٹا دیا گیا تھا۔ کم معیار کے نمونے 1000 UMI اقدار اور 1000 پائے جانے والے جینوں کی کم از کم حد کی بنیاد پر ہٹا دیے گئے۔ بالآخر، 925 ریشوں نے کوالٹی کنٹرول فلٹرنگ کے تمام مراحل کو پاس کیا۔ UMI اقدار کو Seurat SCTransform v2 طریقہ کا استعمال کرتے ہوئے معمول بنایا گیا تھا، 84 بشمول تمام 7418 پتہ چلنے والی خصوصیات، اور شرکاء کے درمیان اختلافات کو دور کر دیا گیا تھا۔ تمام متعلقہ میٹا ڈیٹا سپلیمنٹری ڈیٹا سیٹ 28 میں پایا جا سکتا ہے۔